Luigi Naldini

Tecnologie di trasferimento genico e nuove strategie di terapia genica

Unità SR-Tiget - ERC Advanced Grant
Luigi Naldini, Capo Unità

luigi.naldini@hsr.it

La terapia genica affronta la malattia genetica alla sua base in quanto mira a contrastare o a ripristinare nella cellula affetta la funzione di un gene “difettoso” mediante il trasferimento di una versione corretta e funzionale dello stesso gene o di un suo antagonista. Per realizzare questi obiettivi ambiziosi servono strumenti efficaci per il trasferimento genico, spesso derivati da virus modificati e resi innocui in laboratorio. I virus modificati (vettori virali) entrano nelle cellule bersaglio come se fossero virus naturali, ma invece di trasportare i propri geni introducono il gene terapeutico. La ricerca svolta nel nostro laboratorio ha messo a punto un sistema per trasferire efficientemente e stabilmente geni anche in cellule particolarmente refrattarie ai metodi convenzionali.

Attività di ricerca 

La terapia genica affronta la malattia alla sua origine genetica e mira a ripristinare nelle cellule affette la funzione di un gene “difettoso” o a contrastarne gli effetti negativi mediante l’introduzione di una versione corretta dello stesso gene o di un suo antagonista. Per realizzare questi ambiziosi obiettivi servono strumenti efficaci per trasferire i geni, spesso derivati da virus ingegnerizzati in laboratorio e resi non pericolosi. I virus modificati entrano nelle cellule bersaglio come fossero virus naturali, ma invece di introdurre il proprio patrimonio genetico introducono il gene terapeutico (vettori virali). La ricerca svolta nel nostro laboratorio ha messo a punto una serie di nuovi vettori per trasferire geni efficientemente e stabilmente anche in cellule particolarmente refrattarie ai metodi convenzionali, aprendo la strada a nuove strategie di terapia genica. Siamo stati infatti tra i pionieri dello sviluppo e dell’utilizzo di vettori virali derivati dal virus HIV per la terapia genica, che non solo sono diventati oggi uno degli strumenti sperimentali piu’ utilizzato nei laboratori di ricerca di tutto il mondo, ma si stanno rivelando un efficace e sicuro veicolo per la terapia genica in diverse sperimentazioni cliniche recentemente avviate in centri specializzati tra cui il nostro stesso Istituto SR-Tiget. Abbiamo descritto per la prima volta l’efficacia dei vettori lentivirali in cellule non proliferanti nel 1996. Da allora non solo abbiamo continuato a perfezionare questi strumenti di trasferimento genico e a svilupparne di nuovi, ma anche a sfruttarli per acquisire conoscenze su processi biologici di rilevanza per la medicina, come l’attività delle cellule staminali e l’angiogenesi tumorale, per poi sviluppare nuove strategie terapeutiche per il trattamento di malattie genetiche e del cancro.

Utilizzando i vettori lentivirali abbiamo potuto aumentare l’efficacia del trasferimento genico in cellule staminali ematopoietiche, raggiungendo una elevata frequenza di correzione genica con minima interferenza sulle funzioni cellulari. L’utilizzo dei vettori lentivirali è stato poi ulteriormente incrementato dalla dimostrazione che il disegno sofisticato di questi vettori, inizialmente pensato per scongiurare il rischio di riattivazione del virus di origine, ne ha al tempo stesso aumentato la sicurezza di impiego riducendone il potenziale impatto negativo sul genoma delle cellule in cui si inseriscono. Pertanto, l’alta efficienza di trasferimento genico unita alla dimostrazione sperimentale della loro aumentata sicurezza rispetto ad altri vettori convenzionali precedentemente utilizzati, hanno consentito il recente ingresso dei vettori lentivirali nella sperimentazione clinica.

I nostri sforzi verso l’ottimizzazione delle tecnologie di trasferimento genico hanno sempre avuto come obiettivo finale l’applicazione terapeutica. Come modello paradigmatico per esplorare il potenziale terapeutico offerto dai nuovi vettori lentivirali selezionammo in origine le malattie da accumulo lisosomiale. Dimostrammo che il ripopolamento della microglia con cellule di recente derivazione ematopoietica dopo condizionamento ed infusione di cellule staminali e progenitori può essere sfruttato affinché l’effetto della terapia genica raggiunga il sistema nervoso centrale e periferico e risulti efficace nel trattamento della leucodistrofia metacromatica nel modello murino. Sulla base di questi studi preclinici, nel 2009 avviammo una sperimentazione clinica di terapia genica delle cellule staminali emopoietiche  per la leucodistrofia metacromatica che nell’uomo è invariabilmente letale e al momento senza alcun trattamento efficace. I risultati hanno finora dimostrato che il trattamento è sicuro e fornisce un sostanziale beneficio terapeutico (vedi aggiornamento sui risultati del trial clinico in SR-Tiget Unità di Ricerca Clinica). Questi dati incoraggianti sono alla base di una alleanza strategica con GlaxoSmithKline, volta alla possibilità di trasformare la terapia genica delle cellule staminali in una concreta realtà terapeutica.

In parallelo alla sperimentazione clinica il nostro laboratorio è sempre stato impegnato nello sviluppo di piattaforme lentivirali di nuova generazione, allo scopo di superare i rischi e i limiti ancora associati alle versioni che sono attualmente in corso di sperimentazione. Stiamo anche studiando nuovi approcci per meglio preservare ed espandere le cellule staminali ematopoietiche in coltura, allo scopo di potenziare le possibilità di manipolazione genetica ex vivo.

Lo sviluppo di vettori lentivirali più sicuri ed efficaci prevede anche l’introduzione di una più stringente regolazione dell’espressione del transgene terapeutico. Nel 2006 introducemmo per la prima volta in un vettore genico la regolazione da parte dei microRNA, per meglio controllarne l’espressione. Il vettore viene modificato con l’inserzione di sequenze bersaglio di microRNA cellulari, in modo da renderlo suscettibile alla loro regolazione negativa post-trascrizionale. In questo modo si può prevenire l’espressione del transgene contenuto nel vettore in cellule raggiunte non intenzionalmente dal vettore o in cui si voglia comunque evitarne l’espressione. Si ottiene così un livello sofisticato di controllo dell’espressione del vettore, che può essere specificamente silenziato in risposta alla tipologia delle cellule trasdotte e perfino al loro grado di differenziamento o stato di attivazione. Abbiamo recentemente identificato dei microRNA che esercitano una attività confinata a specifiche sottopopolazioni di cellule ematopoietiche e stiamo sfruttando la regolazione fornita da questi per ottenere una espressione del transgene terapeutico sempre più specifica e mirata alle cellule di interesse (Progetto 1).

Abbiamo poi sviluppato altri vettori lentivirali che possono essere sfruttati per studiare la funzione biologica dei microRNA di interesse. In questo modo abbiamo identificato il ruolo chiave che alcuni microRNA ricoprono nella regolazione della quiescenza e dell’espansione delle cellule staminali ematopoietiche così come nel loro differenziamento. Gli studi in corso sfruttano le tecnologie di saturazione  e sovraespressione di microRNA  per identificarne i target biologici rilevanti mediante approcci di trascrittomica e proteomica, allo scopo di decifrare i processi molecolari su cui agiscono. Questi dati forniranno importanti informazioni su come i processi biologici di quiescenza e differenziamento delle cellule staminali ematopoietiche vengono regolati (Progetto 2).

Siamo stati tra i primi a esplorare approcci di gene targeting basati sull’ingegnerizzazione di Zinc Finger Nucleasi (ZFN) per correggere le sequenze dei geni. Tali strategie danno la possibilità di mirare l’integrazione del vettore in un sito prescelto del genoma e di correggere direttamente le mutazioni di un gene difettoso, riscrivendone la sequenza.  Queste strategie offrono nuove soluzioni radicali per superare i maggiori ostacoli che per lungo tempo hanno frenato il progresso nel campo della terapia genica. La correzione genica, rispetto all’introduzione di una copia funzionale ma aggiuntiva del gene, come effettuato con i vettori convenzionali, non soltanto restituisce la funzione ma ne ripristina anche il controllo fisiologico, evitando le conseguenze potenzialmente tossiche di una espressione de-regolata, costitutiva o ectopica e, al tempo stesso, abrogando i rischi della inserzione causale del vettore nel genoma. Stiamo ottimizzando e sfruttando questo approccio su linfociti, cellule staminali emopoietiche (CSE) e cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) al fine di correggere mutazioni causanti immunodeficienza primaria legata al cromosoma X e altre malattie genetiche (Progetto 3). Contemporaneamente, stiamo sfruttando proteine artificiali leganti specifiche sequenze di DNA per modulare stabilmente le caratteristiche epigenetiche su loci pre-selezionati e silenziare in modo specifico mutazioni dominanti (Progetto 4).

Continuiamo a investigare il potenziale della terapia genica in vivo per trattare malattie sistemiche come l’emofilia, sfruttando le particolari proprietà di una piattaforma di vettori lentivirali specificamente diretta agli epatociti grazie alla combinazione di controlli trascrizionali e post-trascrizionali regolati da microRNA. Grazie a questa strategia, siamo stati in grado di superare la barriera immunologica al trasferimento genico stabile, uno dei maggiori ostacoli al successo della terapia genica, stabilendo così una correzione a lungo termine dell’emofilia in topi e cani affetti e inducendo tolleranza specifica al prodotto del transgene. Ulteriori studi mirano alla traduzione clinica di questa strategia e al suo allargamento alla terapia di un’ampia gamma di malattie metaboliche e autoimmuni. (Progetto 5).

Grazie all’indagine del contributo delle cellule emopoietiche all’angiogenesi, abbiamo stabilito un nuovo paradigma secondo il quale il midollo fornisce una popolazione mieloide necessaria a promuovere la formazione di nuovi vasi. Questi studi hanno aiutato a definire una linea di monociti pro-angiogenici, che partecipano selettivamente al rimodellamento e alla rigenerazione tissutale e possono essere distinti dai monociti convenzionali pro-infiammatori sulla base dell’espressione di geni specifici, marcatori di superficie e proprietà funzionali. Intanto continuiamo a studiare l’origine e la funzione biologica di queste cellule e a sfruttarle per sviluppare nuove strategie terapeutiche. In una prima strategia, ingegnerizziamo le cellule staminali del sangue in modo che la loro progenie monocitaria possa esprimere in modo selettivo un gene terapeutico una volta reclutata nei tumori, aumentandone così l’efficacia ed evitando tossicità sistemica. In una seconda strategia, riscriviamo geneticamente la specificità dei linfociti per indirizzarli in modo efficace e sicuro contro i tumori. (Progetto 6).

 

 

 

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