Istituto San Raffaele Telethon per la Terapia Genica (SR-Tiget)

Unità di studio delle Integrazioni Vettoriali

I vettori lentivirali sono strumenti molto efficaci per la terapia genica grazie alla loro capacità di integrarsi nel genoma dell’ospite. Questo li rende utili anche per marcare geneticamente le cellule in vivo, ma pone preoccupazioni sotto il profilo della sicurezza. L’analisi dei siti di integrazione in cellule bersaglio, quindi, è estremamente importante per affrontare sia problemi biologici sia di biosicurezza.

L’unità di studio delle integrazioni vettoriali (Vector integration core) di SR-Tiget ha allestito svariate nuove tecniche all’avanguardia per lo studio delle integrazioni dei vettori ed il loro impatto sulla struttura e sui livelli di espressione dei trascritti genici. La messa a punto di procedure operative standard validate, di infrastrutture computazionali dedicate e di pipelines per l’analisi dei dati ha permesso a SR-Tiget il monitoraggio di un elevato numero di siti di integrazione in diversi trials clinici e in molti altri progetti scientifici, in modo rapido e conveniente.

Per far fronte alla massiccia quantità di campioni e di dati generati e per permettere la corretta interpretazione del significato biologico di differenze riscontrate nei profili di integrazione, sono in fase di sviluppo nuovi protocolli di laboratorio per l’identificazione di siti di integrazione e per il sequenziamento, nonchè progetti di ricerca bioinformatici.

 

Staff Unità di studio delle Integrazioni Vettoriali
Nome Posizione
Eugenio Montini Capo Unità
Andrea Calabria Postdoc fellow
Fabrizio Benedicenti Tecnico senior
Erika Tenderini Tecnico
Giulio Spinozzi Bioinformatico
Stefano Brasca Statistico

 

Attività di ricerca

Identificazione quantitativa di giunzioni di integrazione del vettore

Abbiamo sviluppato un protocollo automatizzato di PCR mediata da un’amplificazione lineare (LAM-PCR) per l’identificazione di giunzioni vettore/genoma. sono in corso di sviluppo anche nuovi metodi basati sulla sonicazione di DNA e sul sequenziamento di giunzioni vettore/genoma con l’utilizzo della tecnologia di sequenziamento Illumina, al fine di determinare accuratamente l’abbondanza relativa di cloni cellulari ospitanti siti di integrazione specifici in un dato campione biologico. La profondità di sequenziamento Illumina garantisce l’identificazione di un più alto numero di siti di integrazione rispetto ai precedenti metodi di sequenziamento, rafforzando il potere degli studi di sicurezza da un lato e fornendo nuove conoscenze riguardanti la biologia delle cellule staminali dall’altro.

Schema di LAM-PCR per LTR – amplificazione di giunzioni genomiche.

 

Sviluppo di pipeline automatizzate per l’analisi di siti di integrazione (ISs) su ambienti di calcolo distribuiti

L’analisi di siti di integrazione vettoriale cromosomica in cellule marcate con vettore in pazienti sottoposti a terapia genica e in modelli preclinici ha permesso di rilevare in vivo la selezione di mutanti inserzionali con guadagno di funzione prima ancora di una progressione conclamata della malignità. Per questa ragione, negli ultimi anni c’è stato un aumento costante nel sequenziamento e nella mappatura di giunzioni di DNA vettore/genoma, nonchè nello sviluppo di strumenti statistici per migliorare le indagini biologiche e la loro interpretazione. Recentemente, nell’ambito della terapia genica sono stati sfruttati approcci di sequenziamento di nuova generazione (dall’acronimo inglese Next Generation Sequencing – NGS) per migliorare notevolmente il potere di analisi dei siti di integrazione. Tuttavia i progressi analitici con NGS sono accompagnati da forti necessità computazionali, dovuti per esempio dalla produzione massiva di dati in output, che richiedono con alta precisione e sviluppo ad hoc di flussi di lavoro automatizzati (strumenti software comunemente chiamati pipeline) e distribuiti su infrastrutture ad alte prestazioni. A supporto dei biologi e degli sperimentatori sono indispensabili strumenti software ad alte prestazioni, standardizzate e sviluppate per gestire i dati prevenienti da piattaforme NGS.

L’unità ha sviluppato diverse pipeline di bioinformatica su dati NGS per l’analisi di siti di integrazione, sia per piattaforme Illumina sia per piattaforme Roche. Abbiamo progettato l’attività di gestione dell’informazione e della conoscenza in blocchi semantici differenti: (a) controllo qualità delle reads, al fine di eliminare dal dataset le sequenze poco affidabili; (b) pulizia dei dati grezzi e trimming delle sequenze del vettore; (c) raggruppamento e clustering delle reads, per stimare il numero di siti di integrazione prima di mappare le sequenze; (d) mappatura delle sequenze sul genoma di riferimento; (e) filtraggio dei dati post-processamento e raffinamento dei siti di integrazione per analisi successive (ad esempio associazione di siti di integrazione per l’annotazione di caratteristiche genomiche, identificazione di siti di integrazione comuni e stima della complessità come surrogato di diversità clonale di cellule marcate con vettore).

Approccio completo di Data Mining applicato all’analisi dei siti di integrazione

L’analisi di siti di integrazione vettoriali cromosomiche (ISs) in cellule marcate con vettore in pazienti sottoposti a terapia genica è un punto chiave per il monitoraggio dei progressi, in termini di sicurezza ed efficacia, della terapia genica stessa e fornisce nuove conoscenze riguardanti la biologia delle cellule staminali. Attraverso le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) abbiamo sequenziato più di 10x10e6 giunzioni provirus/genoma ospite provenienti dalle cellule di sei pazienti afferenti a due trials clinici basati su cellule staminali ematopoietiche (HSC) trattate con vettori lentivirali autoinattivanti in corso a Milano (leucodistrofia metacromatica e sindrome di Wiskott-Aldrich).

Nel complesso abbiamo recuperato milioni di ISs univocamente mappati, derivanti da migliaia di ISs unici distribuiti in linee cellulari e tessuti raccolte nel corso del tempo. Data la grande quantità di dati da analizzare e la diversità delle variabili associate ad essa, abbiamo adottato un nuovo framework completo di razionalizzazione della conoscenza e data-mining, diviso in tre blocchi principali: (1) processamento di dati NGS, per ottenere una mappatura accurata degli IS; (2) qualità del dato, per filtrate gli ISs attraverso parametri di qualità e utilizzando nuovi metodi per il rilevamento delle contaminazioni e per la normalizzazione dei dati; (3) analisi biologica degli ISs. Il terzo blocco affronta problemi biologici quali: (a) l’identificazione di siti di integrazione comuni (dall’inglese Common Integration Sites), usando un metodo statistico “genecentrico”; (b) studi di abbondanza clonale per tracciare possibili trand dominanti; (c) monitoraggio dell’attività delle cellule staminali durante il tempo analizzando gli ISs condivisi dalle linee cellulari CD34+, mieloide e linfoide; (d) analisi della diversificazione delle popolazioni cellulari tramite studi di clonalità nel tempo e diversità cellulare.

Pubblicazioni selezionate

Ranzani M, Cesana D, Bartholomae CC, Sanvito F, Pala M, Benedicenti F, Gallina P, Sergi LS, Merella S, Bulfone A, Doglioni C, von Kalle C, Kim YJ, Schmidt M, Tonon G, Naldini L, Montini E. Lentiviral vector-based insertional mutagenesis identifies genes associated with liver cancer. Nature Methods. 2013 Feb;10(2):155-61 IF: 23.565, Cited 1 time

Cesana D*, Sgualdino J*, Rudilosso L, Merella S, Naldini L, Montini E. Whole transcriptome characterization of aberrant splicing events induced by lentiviral vector integrations. Journal of Clinical Investigation. 2012. 122(5):1667-76; IF: 14.152; Cited 3 times. (Commentary on JCI same issue from D.Trono: Gene therapy: too much splice can spoil the dish; Highlight in Nature Biotechnology from J. Kreisberg, Safer lentiviral vectors, 30,508, 07 June 2012)

Montini E, Cesana D. Genotoxicity assay for gene therapy vectors in tumor prone Cdkn2a-/- mice. Methods Enzymology. 2012. 507:171-85. IF: 1.626

Biffi A, Bartolomae CC, Cesana D, Cartier N, Aubourg P, Ranzani M, Cesani M, Benedicenti F, Plati T, Rubagotti E, Merella S, Capotondo A, Sgualdino J, Zanetti G, von Kalle C, Schmidt M, Naldini L*, Montini E*. Lentiviral vector common integration sites in Preclinical Models and a Clinical Trial Reflect a Benign Integration Bias and not Oncogenic Selection. Blood. 2011. 117(20):5332-9. IF: 10.558. Cited 21 times.

Cassani B*, Montini E*, Maruggi G, Ambrosi A, Mirolo M, Selleri S, Biral E, Frugnoli I, Hernandez-Trujillo V, Di Serio C, Roncarolo MG, Naldini L, Mavilio F, Aiuti A. Integration of retroviral vectors induces minor changes in the transcriptional activity of T cells from ADA-SCID patients treated with gene therapy. Blood. 2009. 114(17):3546-56. IF: 10.558. Cited 27 times. (*equal contribution)

Montini E*§, Cesana D*, Schmidt M, Sanvito F, Bartholomae C, Ranzani M, Benedicenti F, Sergi Sergi L, Ambrosi A, Ponzoni M, Doglioni C, Di Serio C, von Kalle C, Naldini L§. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of hematopoietic stem cell gene therapy. Journal of Clinical Investigation. 2009. 119(4):964-75. IF: 14.152; Cited 153 times. (Commentary from C. Baum on JCI same issue: Preventing and exploiting the oncogenic potential of integrating gene vectors). (*equal contribution; §co-corresponding authors)

 

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